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Séminaire


Soutenance de thèse

Vers une meilleure compréhension du mécanisme de transfert de soufre par FdhD pour la maturation des formiates déshydrogénases microbiennes

Du 28/06/2019 au 28/06/2019
Pierre-Xavier Mariani (BIAM/MEM)

​Conférencier : Pierre-Xavier Mariani (BIAM/MEM)

Résumé

L'oxydation réversible du formiate en CO2 est catalysée par les formiates déshydrogénases (FDH) grâce à un cofacteur à molybdène, le Mo-bisPGD, dont la sulfuration est essentielle pour leur activité enzymatique. Chez Escherichia coli, le Mo-bisPGD est sulfuré par la protéine soufre-transférase FdhD. FdhD recrute le soufre depuis la cystéine désulfurase IscS et le transfère vers le Mo-bisPGD via un motif à deux cystéines (CXXC) situé sur une boucle catalytique flexible. Les structures cristallographiques séparées des protéines FdhD et IscS sont résolues mais les bases structurales de la formation d'un complexe restent inconnues. FdhD est un dimère, qui porte deux boucles catalytiques pouvant transférer le soufre depuis IscS vers le Mo-bisPGD. IscS étant aussi un dimère, nous pouvons envisager que les deux dimères interagissent symétriquement lors du transfert de soufre. Au cours de ce doctorat, nous avons étudié le mécanisme de transfert de soufre selon deux axes de travail : i) les bases structurales de l'interaction FdhD/IscS, et ii) l'importance fonctionnelle des deux boucles catalytiques flexibles de FdhD. Par des approches de biochimie et de biophysique, nous avons montré que l'interaction FdhD/IscS est à la fois hautement dynamique et hautement affine. Nous avons pu déterminer la stoechiométrie du complexe, FdhD4-IscS2, bien que la structure précise du complexe reste insaisissable. Ces résultats soulèvent la question du rôle de chacune des boucles catalytique alors que dans le complexe FdhD4-IscS2 deux boucles sont présentes pour transférer un seul atome de soufre depuis IscS. À l'aide d'un équivalent chimérique de la protéine FdhD nous avons montré qu'une seule boucle catalytique est suffisante pour sulfurer le Mo-bisPGD efficacement. Cependant, le variant avec une seule cystéine par boucle reste actif bien que moins efficace. De plus, nous avons montré que des homologues de FdhD possédant une seule cystéine par boucle sont actifs. En conclusion, nous proposons un modèle de sulfuration du Mo-bisPGD par FdhD impliquant deux résidus cystéines soit provenant de la même boucle catalytique, soit provenant chacun d'une boucle catalytique différente. Dans ce dernier cas, les boucles coopéreraient afin de fournir les deux cystéines requises pour le transfert de soufre.

Mots clés : cystéine desulfurase, soufre transférase, complexe IscS-FdhD, maturation du cofacteur à molybdène

Abstract

The reversible oxidation of formate into CO2 is catalyzed by formate dehydrogenases (FDH) thanks to the molybdenum cofactor, the Mo-bisPGD, whose sulfuration is essential for enzymatic activity. In Escherichia coli, the Mo-bisPGD is sulfurated by the sulfurtransferase protein FdhD. FdhD recruits sulfur from the cysteine desulfurase IscS and transfers it to the Mo-bisPGD thanks to a double cysteine motif (CXXC) located on one flexible catalytic loop. Although the separate crystallographic structures of FdhD and IscS are solved, the structural basis of complex formation is unknown. FdhD  is a dimer, which displays two catalytic loops that could transfer sulfur from IscS to the Mo-bisPGD and, because IscS is also a dimer, we can hypothesize that both dimers could symmetrically interact to allow sulfur transfer. In this work, we have deciphered the sulfur transfer mechanistics from IscS to FdhD through two main axis: i) the structural basis of FdhD/IscS interaction, and ii) the functional importance of the two flexible catalytic loops of FdhD. Through biochemistry and biophysics approaches, we showed that the FdhD/IscS interaction is highly dynamic yet also of high affinity. We were able to determine a FdhD4-IscS2 complex stoechiometry, however the precise structure of the complex remains elusive. These findings question the role of each catalytic loop in sulfur transfer as in the FdhD4-IscS2 stoechiometry two catalytic loops from FdhD can accept the single sulfur from IscS. With the help of a chimeric FdhD dimer, we showed that a single catalytic loop is sufficient to sulfurate the Mo-bisPGD efficiently. However, the variant with one single cysteine residue harbored by each catalytic loop is still active but at a lower efficiency. Moreover, homologues of FdhD which harbor naturally one single cysteine residue on the catalytic loop are active. In conclusion we propose a model of Mo-bisPGD sulfuration by FdhD involving two cysteine residues either emanating from the same catalytic loop or from the two catalytic loops. In the later case, loops would cooperate to assure sulfur transfer required to obtain active FDH.

 

Infos Pratiques

​​La soutenance aura lieu à partir de 14h à l'IMM, Institut de Microbiologie de la Méditerranée - 31 Chemin Joseph Aiguier - 13009 Marseille

Amphithéâtre Desnuelles.

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