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Thématique de recherche LBC

Résistance au stress radiatif et oxydatif

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Publié le 1 août 2016

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Laurence Blanchard, Arjan DE GROOT

​​​Chercheurs : Pascal ARNOUX, ​David PIGNOL 

Technicien : Géraldine BRANDELET​

Bien qu'essentiels, les métaux sont également inducteurs de stress oxydatif lorsqu'ils sont libérés des protéines endommagées après une exposition à des radiations. Dans ce contexte, nos travaux se focalisent sur la caractérisation de Deinococcus deserti, une souche radiorésistante présentant des caractéristiques originales (notamment par rapport Deinococcus radiodurans) mises en évidence par proteogenomiques compartives (De Groot et al . (2009) PLoS Genet). Notre objectif est de décrypter les mécanismes de résistance microbienne aux rayonnements, à la dessiccation et au stress oxydatif, en mettant l'accent sur les mécanismes de réparation efficace des dommages à l'ADN, les mécanismes de compactage de l'ADN sous forme de nucléoïde très condensé, et sur la production de composés antioxydants (y compris les petits peptides). 

 Etude des mécanismes de l’extrême tolérance de Deinococcus aux radiations et à la dessiccation

Cet axe de recherche, qui a intégré le LBC en juillet 2011, vise à comprendre comment certains organismes résistent à de très fortes doses de radiations ionisantes (de l'ordre des kGy) alors que de très faibles doses (10 Gy) sont létales pour l’homme. Nos objectifs sont donc de caractériser les mécanismes moléculaires qui permettent à la bactérie Deinococcus deserti, isolée en 2005 du désert du Sahara (1), de tolérer des doses très élevées de radiations gamma et UV mais également de longues périodes de dessiccation. Cette extrême tolérance est liée à la réparation très efficace de dommages massifs de l'ADN générés par ces stress, notamment des cassures double-brin qui sont létales pour la plupart des organismes (Fig. 1). Un ensemble de processus, à la fois actifs (réparation efficace de l’ADN) et passifs (super-compaction du nucléoide, mais surtout protection des protéines contre l’oxydation, grâce à la présence dans la cellule de complexes anti-oxydants formés de petites molécules incluant Mn2+, phosphate et peptides) contribuent à la radio-tolérance.

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Fig. 1. Courbe de survie en fonction de doses d’irradiation gamma (gauche). Gel d’électrophorèse en champs pulsés montrant la reconstitution du génome de D. deserti quelques heures après irradiation gamma (6.8 kGy) et après 27 jours de dessiccation (droite) (3​).
Crédit : Arjan de Groot/CEA



Analyse du génome, protéome et transcriptome (RNA-sequencing) 

Pour étudier ces mécanismes, des approches globales ont été mises en place incluant l'analyse exhaustive du génome (3), du protéome (36789) et très récemment du transcriptome par "RNA-sequencing" (10) de D. deserti avant et après stress, permettant d’identifier les gènes/protéines induites et donc potentiellement impliqués dans la radio-tolérance.Notre analyse du transcriptome par RNA-sequencing (10) a permis de proposer une nouvelle explication pour la génération du pool cellulaire de peptides. Nous avons montré que 60% des ARN messagers de D. deserti sont "leaderless" (c.-à-d. n'ont pas de 5' UTR (UnTranslated Region) en amont du site d'initiation de traduction). Un tel pourcentage n’a, à ce jour d’ailleurs, jamais été observé pour une espèce bactérienne. L’utilisation par D. deserti de ce système d’initiation de traduction, plutôt ancestral, permet également la génération de très nombreux peptides importants pour la protection des protéines contre l’oxydation et de ce fait pour la tolérance aux radiations et à la dessiccation​ (10).

Gènes et protéines impliqués dans la radiotolérance​

Après développement des outils génétiques (4), nous avons caractérisé plusieurs gènes/protéines par des approches ciblées (génétique, biochimie et biologie structurale) révélant à la fois des originalités de D. deserti mais aussi des points communs à la famille des Deinococcaceae et des eucaryotes. Ces cibles ont été les trois gènes recA et les gènes codant les trois polymérases translésionnelles identifiés chez D. deserti (4) ; la protéine radio-induite Deinococcus-spécifique DdrA, homologue structural de Rad52 chez l'homme, qui intervient dans la protection des extrémités de l'ADN (2) ; IrrE, le régulateur central de la radio-tolérance, dont la structure 3D a été obtenue par cristallographie révélant une combinaison unique de trois domaines (un domaine N-terminal peptidase-like (bleu), un domaine HTH central et un domaine C-terminal senseur de type GAF (vert)) (5) (Fig. 2).

IrrE est une protéine très importante car nécessaire pour l'expression, après stress, de nombreux gènes clé (notamment recA) impliqués dans la réparation de l'ADN et donc la survie des cellules. Pendant de nombreuses années le mécanisme d'action de IrrE fut inconnu. Nous avons récemment montré que IrrE est une métalloprotéase qui clive et inactive le répresseur transcriptionnel DdrO après exposition des Deinococcus aux radiations (11). Ce nouveau mécanisme de réponse au stress, schématisé dans la figure 2, semble constituer un nouveau système toxin/anti-toxin qui pourrait également être utilisé par des bactéries pathogènes.

 
 Fig. 2. Représentation schématique d'un nouveau mécanisme de réponse aux stress chez les Deinococcus.

Dans les conditions standards, le répresseur DdrO se lie sous forme de dimère au motif palindromique (RDRM) présent au voisinage des promoteurs des gènes régulés par IrrE/DdrO empêchant ainsi la transcription de ces gènes par la polymérase. L'exposition des Deinococcus aux radiations stimule le clivage de DdrO par la métalloprotéase IrrE. DdrO, ne formant plus de dimère, ne se lie plus à l'ADN permettant à la polymérase de transcrire les gènes impliqués dans la réparation
 de l'ADN conduisant à la survie des cellules.

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rédit L. Blanchard et A. de Groot

Nous poursuivons actuellement la caractérisation de ce nouveau mécanisme ainsi que la caractérisation de plusieurs nouvelles cibles trouvées par les approches globales utilisées. Les capacités exceptionnelles de résistance de D. deserti à la dessiccation en font également un excellent candidat pour les approches biotechnologiques développées dans le laboratoire.



Collaborateurs
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  • S. Sommer (Université Paris-Sud, Institut de Génétique et Microbiologie, Orsay)
  • J. Armengaud (CEA Marcoule, IBEB/SBTN/LBSP) 
  • Genoscope (CEA Institut de génomique, Centre National de Séquençage)

Financements

  • ANR blanche « Deinococcus » (2007-2011) - S. Sommer (coordinateur), A de Groot et J. Armengaud (partenaires)

​Publications​ 

1 - De Groot A*, Chapon V, Servant P, Christen R, Fischer-Le Saux M, Sommer S, Heulin T. (2005Deinococcus deserti sp.nov., a gamma-radiation-tolerant bacterium isolated from the Sahara Desert.Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 55, 2441-2446.
2 - Gutsche I, Vujicic-Zagar A, Siebert X, Servant P, Vannier F, Castaing B, Gallet B, Heulin T, De Groot A, Sommer S, Serre L. (2008Complex oligomeric structure of a truncated  form of DdrA: a protein requir​​ed for the extreme radiotolerance of DeinococcusBiochim. Biophys. Acta 1784, 1050-1058.
3 - De Groot A*, Dulermo R, Ortet P, Blanchard L, Guérin P, Fernandez B, Vacherie B, Dossat C, Jolivet E, Siguier P, Chandler M, Barakat M, Dedieu A, Barbe V, Heulin T, Sommer S, Achouak W, Armengaud J. (2009Alliance of proteomics and genomics to unravel the specificities of Sahara bacterium Deinococcus deserti.Plos Genetics5(3), e1000434.
4 - Dulermo R, Fochesato S, Blanchard LDe Groot A* (2009Mutagenic lesion-bypass and two functionally different RecA proteins in Deinococcus desertiMol. Microbiol. 74(1), 194-208.
5 - Vujicic-Zagar A, Dulermo R, Le Gorrec M, Vannier F, Servant P, Sommer S, De Groot A, Serre L. (2009Crystal structure of the IrrE protein, a central regulator of DNA damage repair in DeinococcaceaeJ. Mol. Biol. 386, 704-716.
6 - Baudet M, Ortet P, Gaillard JC, Fernandez B, Guerin P, Enjalbal C, Subra G, De Groot A, Barakat M, Dedieu A, Armengaud J. (2010Proteomic-based refinement of Deinococcus deserti genome annotation reveals an unwonted use of non-canonical translation initiation codonsMol. Cell. Prot. 9(2), 415-426.
7 - Toueille M, Mirabella B, Guérin P, Bouthier de la Tour C, Boisnard S, Nguyen H, Blanchard L, Servant, De Groot A*, Sommer S*, Armengaud J*. (2012A comparative proteomic approach to better define Deinococcus nucleoid specificities.J. Proteomics 75, 2588-2600.
8 - Dedieu A, Sahinovic E, Guérin P, Blanchard L, Fochesato S, Meunier B, de Groot A, Armengaud J. (2013Major soluble proteome changes in Deinococcus deserti over the earliest stages following gamma-ray irradiationProteome Sci.11(1), 3.
9 - Bouthier de la Tour C, Passot F, Toueille M, Mirabella B, Guérin G, Blanchard L, Servant P, de Groot A*, Sommer S*, Armengaud J*. (2013)Comparative proteomics reveals key proteins recruited at the nucleoid of Deinococcus after irradiation-induced DNA damageProteomics, Dec;13(23-24):3457-69.
10 - De Groot A*, Roche D, Fernandez B, Ludanyi M, Cruveiller S, Pignol D, Vallenet D, Armengaud J, Blanchard L. (2014) RNA Sequencing and Proteogenomics Reveal the Importance of Leaderless mRNAs in the Radiation-tolerant BacteriumDeinococcus desertiGenome Biol Evol. Apr;6(4):932-48.
11 - Ludanyi M#Blanchard, L#, Dulermo R, Brandelet G, Bellanger L, Pignol D, Lemaire D, De Groot, A*.(2014) Radiation response in Deinococcus deserti: IrrE is a metalloprotease that cleaves repressor protein DdrO. Mol. Microbiol. ​Oct;94(2):434-49​​.  
12​ - Bruch E.M., De Groot A., Un S., Tabares L.C. (2015) « The effect of gamma-ray irradiation on the Mn(ii) speciation in Deinococcus radiodurans and the potential role of Mn(ii)-orthophosphates » Metallomics ​, May;7(5):908-16.​
13 - Bouthier de la Tour C, Blanchard L, Dulermo R, Ludanyi M, Devigne D, Armengaud J, Sommer S., De Groot A* (2015) The abundant and essential HU proteins in Deinococcus deserti and Deinococcus radiodurans are translated from leaderless mRNA. M​icrobiology  ​​​​​Dec;161(12):2410-22.